在全球范围内，由蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒事件占所有食物中毒事件的 1. 4% ～12. 0%。

多年前，青岛某中学部分学生因食用学校食堂提供的午餐(盒饭)， 多名学生出现呕吐、腹泻、腹痛、发热等症状，疑似食物中毒。流调人员采集了部分病人的呕吐物、便样和剩余食物，于当天将样品带回到实验室进行检验。发现引起食物中毒的元凶是蜡样芽孢杆菌。

此外，2015年我国西南地区某小学学生因食用没有冷藏的米饭导致头昏呕吐的事件，2018年美国德克萨斯州在顾客中式自助餐馆用餐后患“炒饭综合征”事件，2023年日本“吉田屋”由于米饭温度管理不当，致270人食物中毒……。

主要是外卖、食堂或餐厅在运输或保存米饭时保存温度不合适，致使蜡样芽胞杆菌在室温下迅速繁殖，进而产生毒素导致。

关于蜡样芽胞杆菌

蜡样芽胞杆菌( Bacillus cereus) 是一种革兰氏阳性菌，也是一种重要的食源性条件致病菌，在自然界中广泛存在，其产生的毒素可以引起食物中毒。蜡样芽孢杆菌产生呕吐毒素与外界温度有关，在20℃-37℃的环境中，毒素的产量最高，夏季室温保存下的米饭类食物最容易受蜡样芽孢杆菌污染。被蜡样芽孢杆菌污染的食物在高温加热后，即使蜡样芽孢杆菌被杀死，但耐热的呕吐毒素仍可保持毒性，导致食物中毒。

目前蜡样芽胞杆菌食物的检测标准 GB/T4789. 14—2014，采用实时荧光定量 PCR方法对蜡样芽胞杆菌呕吐毒素毒力基因 ces 进行检测。操作程序复杂，实验周期长，而且不能区分蜡样芽胞杆菌是否产呕吐毒素。

此外，蜡样芽胞杆菌呕吐毒素是食品原料中的生长过程中产生，具有极强的耐热性和化学稳定 性使其难以被消除和破坏，在某些中毒事件中虽然没有分离到蜡样芽胞杆菌，但检测到了蜡样芽胞杆菌呕吐毒素。因此迫切需要开发快速、准确的蜡样芽胞杆菌呕吐毒素检测方法以有效控制食品污染。

食品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定

具体实验方案～

1、适用范围

本文件适用于面米制品、乳及乳制品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定，也适用于食物中毒呕吐物中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素的测定。

2、标准品

蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准溶液（C57H96N6O18，CAS 号：157232-64-9），浓度为 25μg/500μL 或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

13C6-蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准溶液（C5113C6H96N6O18，CAS号1487375-69-8），浓度为 20 µg/mL或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3、标准溶液配制

3.1、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准中间液（1.0 mg/L）：准确吸取标准溶液0.200 mL 置于10.0 mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至 10.0 mL，浓度为 1.0 mg/L 的标准中间液，于-18 ℃冷冻保存，有效期 3 个月。

3.2、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标标准中间液（1.0 mg/L）：准确吸取标准溶液0.500mL，置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，用乙腈溶液定容至 10.0 mL，浓度为 1.0 mg/L 的标准中间液，于-18 ℃冷 冻保存，有效期3个月。

3.3、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素标准工作液（0. 1 mg/L）：准确吸取标准中间液1.0 mL（1.0 mg/L）置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀释成 0. 1 mg/L 的标准工作液，— 18 ℃冷冻保存，有效期1个月。

3.4、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素内标标准工作液（0. 1 mg/L）：准确吸取内标标准中间溶液1.0 mL，置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，并用乙腈溶液稀释成 0. 1 mg/L 的内标标准工作液，于-18 ℃冷冻保存， 有效期1个月。

3.5、标准系列工作溶液：准确吸取 0. 1 mg/L 的标准工作液，10 μL 、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1000 μL 分别置于 10.0 mL 容量瓶中，加入 200 μL 0. 1 mg/L 的内标标准工作液，用初始流动相制成浓度分别为 0. 1 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L 的标准系列溶液，含内标浓度为 2.0μg/L，现用现配。

4、食品试样提取

称取1 g（精确至0.01 g）均质后的食品样品置于15 mL离心管，加入内标标准工作液（1 mg/L）20 µL，静置30 min后，准确加入5.0 mL乙腈，涡旋混均30 s，超声30 min。4 ℃下12 000 r/min离心10 min 。转移全部上清液至15 mL离心管中，加入5.0 mL水，涡旋混合30 s ，待HLB-P（AN60F098）柱净化。

5、样品净化

(1) 食品试样净化

HLB-P柱经3.0 mL甲醇，3.0 mL纯水依次活化，取食品样品提取液上样（如果上柱溶液粘度较大，过滤较为缓慢，可以1.2 mL/min 速度抽滤过柱），待上样液完全过柱后，以3.0 mL纯水淋洗小柱，5.0 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮气浓缩至近干，残渣用1.0 mL初始流动相复溶，过微孔滤膜供上机测定。

(2) 食物中毒呕吐物样品净化

吸取食物中毒呕吐物样品提取液5.0 mL，直接上HMR（AN60F245）脂质增强去除小柱净化，弃去前0.5 mL过柱液后收集2.0 mL过柱溶液，过膜供上机测定。

6、超高效液相色谱-串联质谱仪器参考条件

a) 色谱柱：Leosil Gold Protein C18 300Å, for Cereulide, 3µm, 100 x 2.1 mm（AN80A364）。

b)流动相：流动相A相为0. 1%甲酸乙腈溶液，B相为0. 1%甲酸-2.0 mmol/L乙酸铵水溶液。

c) 流速：0.35 mL/min

d)柱温：40 ℃

e)进样量：5 µL

梯度洗脱程序见表

a) 离子化模式：电喷雾电正离子模式（ESI+ )；

b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；

c) 毛细管电压： 3.5 kV；

d) 离子源温度：150 ℃；

e) 脱溶剂温度：500 ℃；

f) 脱溶剂气流量：1000 L/h；

g) 碰撞室压力：0. 36 Pa；

h) 监测参数见表2。

蜡样芽胞杆菌呕吐毒素监测参数

7、回收率

8、谱图

炒米饭基质混合标准溶液的二级质谱的离子图( 5.0μg /kg)

中毒样品稀释50倍后蜡样芽胞杆菌呕吐毒素总离子流图( 7398 μg /kg)

原料样品中蜡样芽胞杆菌呕吐毒素总离子流图( 0. 4 μg /kg)

关键耗材配套方案